香烟烟雾提取物对RLE-6TN细胞的损伤以及萝卜硫素和N-乙酰半胱氨酸的保护作用

【摘要】研究背景：香烟烟雾作为慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)发病的重要危险因素,其对上皮细胞的损伤是通过多种复杂机制产生的,其中氧化应激是重要的部分。萝卜硫素(sulforaphane,SFN)对细胞产生的保护作用是通过激活Nrf2-ARE信号通路进而实现的抗氧化保护作用,N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)作为一种已知抗氧化作用明确的保护剂,在本实验中进行使用。研究目的：观察SFN对于在香烟烟雾刺激下RLE-6TN细胞的保护作用及初步探讨其机制,并进一步观察NAC对RLE-6TN细胞的保护作用。研究方法：选用RLE-6TN细胞进行常规培养,分成如下4组：不经处理的对照组(control),只加入5%香烟烟雾提取物(cigarettesmokeextract,CSE)的5%CSE组,经过0.5μMSFN预处理12小时后再加入5%CSE的SFN+5%CSE组以及同时加入lmMNAC和5%CSE的NAC+5%CSE组。使用MTT法检测不同浓度的香烟烟雾提取物以及萝卜硫素对细胞活性的影响。使用Hoechst33258进行细胞核染色观察形态改变。使用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,周期改变以及使用DCFH-DA探针检测细胞内活性氧的水平。使用RT-PCR法和WesternBlot法分别检测Nrf2在mRNA以及蛋白水平的表达。另外使用RT-PCR法检测了与细胞周期调控和凋亡相关的细胞因子IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-5以及P53、P21的mRNA表达情况。实验结果：根据MTT法的检测结果,我们选用5%CSE作为对RLE-6TN细胞的刺激的损伤浓度,用0.5μM的SFN对细胞进行12小时的预处理。通过流式细胞术,观察到CSE的刺激使RLE-6TN细胞周期发生G1期阻滞,而在SFN预处理组和NAC处理组,阻滞现象得到缓解；SFN和NAC能分别使CSE导致的RLE-6TN细胞凋亡现象(%)由78.08±0.97降低至6.12±0.33和12.35±1.16,并使CSE刺激下细胞内活性氧水平(%)由86.63±1.21降低至28.03±0.26和58.27±2.77。根据RT-PCR的实验结果显示SFN能够明显促进Nrf2mRNA的表达,与对照组相比增高达8倍；同时WesternBlot结果提示SFN和NAC均可促进Nrf2在蛋白水平的表达。根据RT-PCR法对IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-5以及P53、P21在mRNA水平表达情况的检测结果表明,当RLE-6TN细胞受到CSE的氧化损伤刺激后,IGFBP-3、IGFBP-5和P53的mRNA表达上升有显著性意义,而通过SFN的预处理后,IGFBP-5mRNA的表达与香烟组对比有显著性差异,经过NAC的保护后,IGFBP-3、IGFBP-5和P53的mRNA表达均显著性降低。结论：香烟烟雾提取物对RLE-6TN细胞造成的损伤呈现毒性剂量依赖关系,引起细胞活性氧含量明显增高,并造成细胞凋亡现象。而SFN和NAC能够有效降低细胞内ROS的产生,缓解由于CSE刺激所造成的细胞周期阻滞,并拮抗细胞凋亡,其作用机理可能与促进Nrf2的高表达有关。此外,SFN和NAC均可减低CSE刺激下增高的IGFBP-3、IGFBP-5和P53的mRNA表达水平,提示SFN和NAC还有可能通过对上述因子的调节来促进细胞增殖和损伤修复。
【作者】常嘉琛；
【导师】焦宗宪；
【作者基本信息】兰州大学，病理学与病理生理学，2014，硕士
【关键词】香烟烟雾提取物；肺泡Ⅱ型上皮细胞；萝卜硫素；Nrf2；N-乙酰半胱氨酸；

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